رنگ آمیزی سلول های پوششی دهان

تئوری :

یکی از اصول و روش های مطالعه سلول های گیاهی و جانوری استفاده از متد رنگ آمیزی است.بااستفاده از رنگ های مختلف زیستی می توانیم اجزا و ارگانرهای مختلف سلول را رنگ آمیزی کنیم.

اساس و پایه رنگ آمیزی ترکیب مولکول های ماده رنگی مورد نظر با مولکول های اندام یا اجزای هدف می باشد.تعدادی از مواد رنگی به صورت رنگ عمومی کاربرد دارد و برخی از رنگ ها مثل سبز ژانوس رنگ اختصاصی میتوکندری و یا قرمز خنثی برای رنگ آمیزی واکوئل است.رنگ های زیستی به رنگ هایی اطلاق می شود که هیچ گونه اثر سوئی در سلول های زنده نداشته باشد.

یک تعداد از رنگ های مورد استفاده رنگ های اسیدی و یک عده دیگر جز رنگ های بازی است که این مواد هم با قسمت های آنیونی و کاتیونی غشای اندامک ها ترکیب می شوند و موجب رنگی شدن آن دیواره ها می شوند.

باشد.تعدادی از مواد رنگی به صورت رنگ عمومی کاربرد دارد و برخی از رنگ ها مثل سبز ژانوس رنگ اختصاصی میتوکندری و یا قرمز خنثی برای رنگ آمیزی واکوئل است.رنگ های زیستی به رنگ هایی اطلاق می شود که هیچ گونه اثر سوئی در سلول های زنده نداشته باشد.

یک تعداد از رنگ های مورد استفاده رنگ های اسیدی و یک عده دیگر جز رنگ های بازی است که این مواد هم با قسمت های آنیونی و کاتیونی غشای اندامک ها ترکیب می شوند و موجب رنگی شدن آن دیواره ها می شوند.

اجزای مختلف یاخته زنده به علت دارا بودن اختلاف غلظت و ضریب شکست بسیار کم به هنگام جذب طیف نور مرئی ، به قدر کافی کنتراست یا اختلاف میزان نور از خودشان نمی‌دهند. رنگهای زیستی ، بدون اینکه اندامکهای یاخته را بی‌جان سازند، آنها را بطور انتخابی رنگ‌آمیزی می‌کنند.

روش انجام آزمایش :

ابتدا لام ها را از قسمت پهنش از طرف داخل به گونه کشیده تا کمی از سلول های پوشاننده ی دهان را بر دارد سپس یک قطره آب روی لام میگذاریم و آن را آرام به روی قسمت خیس لام میکشیم تا سلول های جدا شده ی گونه به روی آن منتقل شود.

سپس چند قطره از رنگ های زیستی را با آب مقطر رقیق کرده به گوشه ی نمونه اضافه می کنیم تا کم کم در سطح نمونه پخش شود بعد یک لامل برداشته و آن را روی نمونه می گذاریم. حال می توانیم سلول های رنگ شده ی گونه را با عدسی ۴۰ مشاهده کنیم.

تعیین طول عرض و ضخامت سلول

تئوری :

پر سلولی دارای ۳بعد طول عرض و ضخامت یا عمق است.در بررسی ابعاد سلولی از از ۲ روش کلی دستی و دستگاهی استفاده می شود.

در روش دستی می توان یا از اکولارگراتیکول بهمراه لام خاص آن استفاده کرد و یا از سیستم درجه بندی خود میکروسکوپ بهره گرفت . در روش دستی و دقیق اکولار لنزی است که قسمت میانی آن مدرج است . در روش دستی تقریبی از سیستم درجه بندی خود میکروسکوپ بهمراه سلول های بشره پیاز استفاده می شود.

روش دستی تقریبی(با استفاده از سیستم ورنیه خود میکروسکوپ)بیشتر در مورد بررسی سلول های گیاهی بکار می رود.

روش دستی دقیق(لام میکرومتری و اکولارگراتیکول)بیشتر در بررسی باکتری ها بکار می رود.

ابعاد سلولی

اکثر سلولها میکروسکوپی بوده و با چشم غیر مسلح دیده نمی‌شوند. سلولهای شاخص حیوانی و گیاهی ، دارای قطری حدود ۵ – ۱۰۰ میکرومتر بوده ( ^۶-۱۰ متر) و بسیاری از باکتریهای تنها ۱ – ۲ میکرومتر طول دارند. چه چیزی ابعاد سلولی را محدود می‌نماید؟ به حداقل اندازه سلول احتمالا حداقل تعداد هر نوع بیومولکول مورد نیاز سلول ، تعیین می‌گردد.

• کوچکترین سلولها ، باکتریهای خاصی به نام مایکوپلاسماها ، دارای قطری حدود ۳۰۰ نانومتر (^۹-۱۰ متر) و حجمی در حد ^۱۴-۱۰ میلی لیتر می‌باشند. بلند ترین بعد یک ریبوزوم باکتریایی حدود ۲۰ نانومتر بوده و بنابراین چند ریبوزوم موجود در سلول مایکوپلاسمایی ، کسر مهمی از حجم سلول را شامل می‌گردد. سلولی با این اندازه ، تنها شامل ۶۰۰۰ مولکول از متبولیتها می‌باشد.
• حد بالای اندازه سلول احتمالا توسط میزان انتشار مولکولهای حل شده در سیستمهای آبی ، تنظیم می‌گردد. یک سلول باکتری که برای تولید انرژی وابسته به واکنشهای مصرف اکسیژن می‌باشد (سلول هوازی) می‌بایست اکسیژن مولکولی را از محیط اطراف ، از طریق انتشار و از میان غشای پلاسمایی خود به دست آورد. این سلول بسیار کوچک بوده و نسبت سطح به حجم آنقدر بزرگی دارد که اکسیژن انتشار یافته به داخل سلول ، براحتی به هر قسمتی از سیتوپلاسم آن می‌رسد.
• از بزرگترین سلولها می‌توان سلولهای ماهیچه‌های اسکلتی پستانداران (در حدود ۱۲ سانتیمتر) و سلولهای عصبی (که در برخی از حیوانات بیش از یک متر طول دارد) را نام برد. قطر گلبول قرمز انسان در حدود ۷ میکرون و اندازه سلول تخم انسان در حدود ۰٫۲ میلیمتر است و با چشم غیر مسلح قابل روئیت می‌باشد. حال آنکه اسپرماتوزئید طولی در حدود ۵۷ میکرون دارد. بطور کلی اندازه سلولها تابع تنوع پذیری موجودات زنده بوده ، ولی برای هر موجود زنده و سلول معینی کاملا ثابت بوده و ارتباط بین سطح غشا و حجم سلول و همچنین ارتبلط بین حجم هسته و حجم سلول ، تعیین کننده این اندازه می‌باشد.

روش انجام آزمایش :

۱تکه از بشره پیاز را با دقت (بدون چروکیدگی و بدون ایجاد حباب)روی لام قرار می دهیم و رنگ لوگل یا استواورسئین اضافه کرده سپس با دقت لامل را قرار می دهیم. پس از چند دقیقه با عدسی شیئی ۱۰ برای طول و عرض و با عدسی شیئی ۴۰ برای محاسبه عمق استفاده می کنیم . سپس با افزودن آب مقطر به همین نمونه و اندازه گیری طول و عرض و عمق نتایج را در دو حالت رنگ آمیزی و بدون رنگ آمیزی با هم مقایسه می کنیم.

ابتدا یک سلول را روی ساعت۱۲ میدان دید قرار داده شاخص عددی ورنیه را با عدسی ۱۰ می خوانیم سپس سلول را در راستای قطب حرکت می دهیم تا به ساعت ۶ میدان دید برسد در همین زمان تعداد سلول ها را نیز می شمریم و عدد ورنیه میکروسکوپ را نیز یادداشت می کنیم.

۱۰۰۰  (عدد در ساعت ۶)-(عدد در ساعت ۱۲)  عرض سلول

برای محاسبه طول سلول نیز به همین نحو نیز عمل می کنیم اما از ساعت ۹ به ساعت ۳ تعداد سلول ها شمارش می شود و درجه دیگر سیستم ورنیه میکروسکوپ در روی صفحه نمونه استفاده می شود(از همان عدسی ۱۰ استفاده می شود.)

اما برای محاسبه ی عمق یا ضخامت سلول از پیچ های ماکرو و میکرو و درجه بندی روی آن ها استفاده می شود و از عدسی شیئی ۴۰ استفاده می شود.

در ابتدا با استفاده از پیچ میکرو هسته ی یک سلول را واضح می کنیم  و عدد شاخص روی پیچ ها را یادداشت می کنیم سپس با تغییر پیچ میکرو سعی می کنیم دیواره همان سلول را به طور واضح مشاهده می کنیم و عدد شاخص را مجددا یادداشت می کنیم. اختلاف بین این دو عدد معرف ضخامت سلول است.

رنگ آمیزی اسپور به روش فولتون و شیفر

مقدمه :

اسپور

اسپور درباکتری ها یک فرم مقاوم است و فرم زایشی نیست ،  و این برخلاف کپک ها و مخمرهای قارچی است . از هرباکتری فقط یک اسپور به وجود می آید و از هر اسپور نیز یک باکتری به وجود می آید.

اسپورها فقط در باکتری هایی تولید می شوند که ژن های مخصوص اسپور زایی داشته باشند. اسپور زایی یک وجه تشخیص و افتراق برای باکتری است . در فرایند اسپور زایی ۲۰۰ ژن دخالت دارند. باکتری ها در زمان احساس خطر اگر ژن اسپورزایی داشته باشند خود را به اسپور تبدیل می کنند.

منظور از عوامل نامساعد محیطی عواملی چون : حرارت ، رطوبت ، تشعشعات مثل نور فرا بنفش و PH است.

درزمان شرایط نامساعد محیطی حدود ۲۰۰ ژن گفته شده یکی یکی شروع به فعال شدن می کنند و سیتوپلاسم خشک می شود. همزمان با این اتفاق DNA  سلول همانند سازی می کند. قسمتی از DNA که همانند سازی شده از قسمت اصلی جدا می شود.

مواد سیتو پلاسمی متراکم شده و در اطراف یکی از کپی های باکتری جمع می شوند. قسمتی از سیتوپلاسم متراکم شده و اطراف آن غشا و دیواره تشکیل می شود که ترکیباتی چون D.P کولینات کلسیم ( سیمان غشا اسپور) در آن وجود دارد. دیواره اسپور به مرور زمان ضخامتش زیاد شده و در قسمتی از سلول جایگزین می شود. در این حالت باکتری به خواب می رود.

میزان سوخت و ساز اسپور کمترین مقدار ممکن است. به اسپوری که به ای حالت تولید شده آندواسپور می گویند و  به اسپوری که از باکتری خارج می شود اگزو اسپور می گویند. موقعیت قرار گیری اسپوردر داخل باکتری متفاوت است ، به طوری که:

۱-   اگر دروسط سلول تشکیل شود central

2-   اگر اسپور در یکی از دو انتهای باکتری تشکیل شود terminal

3-   اگر اسپور مابین انتها و وسط سلول تشکیل شود sub terminal

اسپور از نظر شکلی به دو شکل گرد و یا بیضوی است. قطر اسپور می تواند از قطر باکتری بزرگتر باشد که آن را Bulbing می گویند( باکتری باد کرده).

باکتری هایی که اکثرا اسپور تولید می کنند مربوط به خانواده با سیلاسه هستند.

۱-   باسیلوس

۲-   کلستریدیوم

همگی این خانواده به صورت میله ایند. در کوکسی ها هم برخی اسپور تولید می کنند که به آنها اسپوروسالسینا می گویند.

عمل تبدیل اسپور به فرم فعال را جوانه زدن می گویند ( germination )

اجزا اسپور عبارتند از:

۱) core ( قسمت مرکزی ) : حاوی سیتوپلاسم متراکم، DNA ، ریبوزوم ، RNA ، آنزیم های که همیشه کاربرد دارند.

۲) لایه ای به نام core wall ( دیواره اسپور) : شامل دو قسمت دیواره سلولی و غشاسیتوپلاسمی است.

۳) لایه ای به نام  cortex.

4) لایه ای به نام spore coat  ( پوشش های اسپور): بیشتر از یک لایه است.

۵) قسمت بیرونی به نام Exosporium .

برای رنگ آمیزی اسپورها  ۳ روش وجود دارد:

۱-                                                              wirty Conklin

2-                                                              schaeffer – falton

3-                                                              dorner

مالاشیت گرین ……………………………………………………………………………………………………….

از مالاشیت گرین در صنعت به عنوان دارویی برای مقابله با انگل ها و قارچ های آبی استفاده می شود. این ماده به طور معمول در مراکز تولید مصنوعی ماهی کپور معمولی ( Cyprinus carpio ) به عنوان داروی ضد قارچ استفاده می شود ، اما این دارو به عنوان عامل بروز ناهنجاری ، ماده ای جهش زا ، عامل پیش سرطان ، آلوده کننده ی محیط های آبی شناخته و مصرف آن ممنوع گردید ، اگر چه همچنان در بسیاری از مراکز تکثیر و پرورش آبزیان در ایران از این ماده استفاده می شود. از جمله موادی که می توان به جای مالاشیت گرین استفاده کرد ، پراکسید هیدروژن ( H₂O₂ ) است. آژانس دارو و غذای آمریکا (FDA ) پراکسید هیدروژن را در گروه دارو های کم ضرر ( با اولویت نظارت کم   LPR ) رده بندی کرده است.

آزمایش:

در اینجا ما برای رنگ آمیزی اسپور ها از روش  schaeffer – falton استفاده می کنیم. در رنگ آمیزی wirty Conklin  تمامی مراحل مانند رنگ آمیزی schaeffer – falton است با این تفاوت که هنگامی که رنگ مالاشیت گرین را اضافه کردیم حرارت نمی دهیم و در رنگ آمیزی DORNER   نیز از نکروزین استفاده می کنیم. بعد از انجام آزمایش خواهیم دید اسپور باکتری ها در کدام قسمت قرار گرفته است ، داخل ( Center , terminal , sub terminal  ) یا خارج باکتری.

ابزار و مواد مورد نیاز آزمایش:

مالاشیت گرین ، سافرانین ، آنس حلقوی ، لام ، گیره ، سینی رنگ آمیزی ، پلیت حاوی باکتری

شرح آزمایش:

در اول باید یک گسترش ( Smear ) تهیه کنیم. آنس حلقوب را با حرارت ضد عفونی می کنیم و با آن یک قطره آب روی لام می گذاریم. از پیپت باکتری ، در کنار شعله با آنس حلقوی ، مقداری باکتری بر می داریم و در قطره آب روی لام پخش می کنیم. پس از خشک شدن آن را روی شعله می گیریم تا ثابت شود.

حال محلول مالاشیت گرین را روی لام میرزیم و به مدت۳ تا ۵ دقیقه حرارت می دهیم اما این حرارت نباید به طوری باشد که سبب تبخیر مالاشیت گرین شود. پس از این لام را با آب شستشو می دهیم و محلول سافرانین را روی لام میریزیم. پس از گذشت یک دقیقه آن را با آب  شستشو می دهیم زیر نور لامپ قرار می دهیم تا خشک شود.

بعد از خشک شدن لام می توانیم آن را با میکروسکوپ بررسی کنیم. مقداری روغن ایمرسون یا سدر به آن اضافه می کنیم و با عدسی ۱۰۰ می توانیم مشاهده کنیم.

در مشاهده خواهیم دید که اسپورها سبز رنگ ( به رنگ مالاشیت گرین) و سلول های رویشی باکتری قرمز رنگ ( به رنگ سافرانین ) هستند. اسپورها را در دو حالی بیرونی ( External ) و داخلی ((  Internal  مشاهده می شود.